Hoe de zuiverheid van een peptide wordt gemeten: HPLC en massaspectrometrie

Zuiverheid is veruit de belangrijkste kwaliteitsmaatstaf voor een onderzoekspeptide. Een sequentie die 80% zuiver is, gedraagt zich heel anders dan een sequentie die 98% zuiver is, en de aard van de verontreinigingen — niet alleen de hoeveelheid — kan een experiment vertekenen. Twee analytische technieken domineren de bepaling van zuiverheid: hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en massaspectrometrie (MS).

Wat zuiverheid werkelijk betekent

Zuiverheid verwijst doorgaans naar het aandeel van het doelpeptide ten opzichte van verwante verontreinigingen: afgeknotte sequenties, deletieproducten, onvolledige ontscherming van zijketens en vergelijkbare bijproducten van de synthese. Zij wordt meestal gerapporteerd als een oppervlaktepercentage en niet als een absoluut gewicht.

HPLC: het mengsel scheiden

Reversed-phase-HPLC voert het monster door een kolom die de componenten scheidt op hydrofobiciteit. Een UV-detector, doorgaans afgelezen bij 214 of 220 nm, levert een chromatogram waarin elke component als een piek verschijnt. Het oppervlak van de doelpiek gedeeld door het totale oppervlak van alle pieken geeft de gerapporteerde zuiverheid. Eén enkele, goed gescheiden dominante piek wijst op een zuiver preparaat.

Massaspectrometrie: de identiteit bevestigen

HPLC vertelt u hoeveel; massaspectrometrie vertelt u wat. Door de moleculen te ioniseren en hun massa-ladingverhouding te meten, bevestigt MS dat het gemeten molecuulgewicht overeenkomt met de verwachte waarde voor de sequentie. Technieken zoals ESI-MS en MALDI-TOF kunnen daarnaast deleties of adducten aan het licht brengen die met HPLC alleen onopgemerkt zouden mee-elueren.

Waarom beide nodig zijn

Geen van beide methoden volstaat op zichzelf. HPLC kwantificeert, maar kan een verontreiniging missen die dezelfde retentietijd heeft als het doelpeptide; MS bevestigt de identiteit, maar is van nature niet kwantitatief. Samen leveren ze een verdedigbaar beeld op, en daarom wordt elke batch van Vela geleverd met een analysecertificaat waarin beide worden gecombineerd. Voor hulp bij het interpreteren daarvan verwijzen wij u naar ons artikel over het lezen van een specificatieblad van een peptide.