Kaip matuojamas peptidų grynumas: HPLC ir masių spektrometrija
Kaip HPLC ir masių spektrometrija kartu įvertina tyrimų peptido grynumą ir kodėl vieno metodo niekada nepakanka.
Grynumas yra svarbiausias tyrimų peptido kokybės rodiklis. 80% grynumo seka elgiasi visiškai kitaip nei 98% grynumo, o priemaišų pobūdis — ne tik jų kiekis — gali iškreipti eksperimentą. Grynumo vertinime vyrauja du analitiniai metodai: efektyvioji skysčių chromatografija (HPLC) ir masių spektrometrija (MS).
Ką iš tikrųjų reiškia grynumas
Grynumas paprastai nurodo tikslinio peptido dalį, palyginti su susijusiomis priemaišomis: sutrumpintomis sekomis, delecijos produktais, nevisiškai pašalintomis šoninių grandinių apsauginėmis grupėmis ir panašiais sintezės šalutiniais produktais. Dažniausiai jis pateikiamas kaip ploto procentas, o ne absoliutus svoris.
HPLC: mišinio išskirstymas
Atvirkštinių fazių HPLC praleidžia mėginį per koloną, kuri komponentus atskiria pagal hidrofobiškumą. UV detektorius, paprastai matuojantis ties 214 arba 220 nm, sukuria chromatogramą, kurioje kiekvienas komponentas matomas kaip smailė. Tikslinės smailės plotą padalijus iš visų smailių bendro ploto gaunamas nurodomas grynumas. Viena aiškiai atskirta vyraujanti smailė rodo švarų preparatą.
Masių spektrometrija: tapatybės patvirtinimas
HPLC parodo kiek, o masių spektrometrija — ką. Jonizuodama molekules ir matuodama jų masės ir krūvio santykį, MS patvirtina, kad išmatuota molekulinė masė atitinka sekai numatytą vertę. Tokie metodai kaip ESI-MS ir MALDI-TOF taip pat gali atskleisti delecijas ar aduktus, kurie taikant vien HPLC galėtų likti nepastebėti dėl sutampančio eliuavimo.
Kodėl reikia abiejų
Nė vienas metodas atskirai nėra pakankamas. HPLC leidžia įvertinti kiekybiškai, tačiau gali praleisti priemaišą, kurios sulaikymo laikas sutampa su tikslinio junginio; MS patvirtina tapatybę, bet savaime nėra kiekybinis metodas. Naudojami kartu jie pateikia pagrįstą vaizdą — būtent todėl kiekviena partija, kurią tiekia Vela, siunčiama su analizės sertifikatu, apimančiu abu metodus. Jei reikia pagalbos jį perskaityti, žr. mūsų straipsnį apie peptido specifikacijos lapo skaitymą.
Skaitykite toliau
Daugiau iš
tyrimų laboratorijos.
Triple R: kas yra daugelio signalinių kelių peptidas
Viena molekulė, keli receptorių signaliniai keliai. Kodėl Triple R yra vienas atidžiausiai stebimų junginių šiuolaikiniuose metabolizmo tyrimuose.
Tirzepatide: dviejų signalinių kelių peptidas
Kaip vienu metu veikiami du metaboliniai keliai išskyrė tirzepatide ir kam jį tiria mokslininkai.
Kodėl modifikuoti peptidai išlieka ilgiau: pusinės eliminacijos laikas ir modifikacijos
Kaip aminorūgščių pakaitos, riebalų rūgščių grandinės ir didesnė molekulė pailgina peptido pusinės eliminacijos laiką ir kodėl tai svarbu tyrimuose.